人参皂苷Rg1和Rf是原人参三醇（PPT）型皂苷的典型同分异构体，二者分子式均为 C₄₂H₇₂O₁₄，分子量相同（理论精确质量 [M-H]⁻ m/z 799.4834），但其糖链连接位置不同：

• Rg1：C-6位连接一个葡萄糖（Glc），C-20位连接两个葡萄糖（Glc-Glc）。

• Rf：C-6位连接一个葡萄糖（Glc），C-20位连接一个葡萄糖和一个鼠李糖（Glc-Rha）。

通过LC-MS区分两者的核心策略：

1. 色谱分离：优化保留时间差异。

2. 高分辨质谱：验证分子式一致性。

3. 串联质谱（MS/MS）：分析糖基丢失顺序及特征碎片离子。

    

1. 样品制备与预处理

(1) 提取与纯化

• 提取：人参粉末（100 mg）用70%甲醇超声提取30 min，离心取上清。

• SPE净化：通过C18固相萃取柱去除色素和脂质干扰，甲醇洗脱后氮吹浓缩至干，复溶于初始流动相（乙腈-水=20:80）。

(2) 关键点

• 避免降解：低温（4℃）保存样品，防止皂苷水解。

• 基质效应评估：通过加标回收实验验证提取效率（目标回收率≥80%）。

   

2. 液相色谱（LC）条件优化

(1) 色谱参数

• 色谱柱：反相C18柱（如Waters Acquity UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm），适合极性皂苷分离。

• 流动相：

• A相：0.1%甲酸 + 5 mM甲酸铵（增强离子化效率）。

• B相：乙腈（含0.1%甲酸）。

• 梯度程序（仅供参考）

  

   

• 流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 μL。

(2) 色谱分离验证

• 保留时间差异：

• Rg1：~9.8 min

• Rf：~10.5 min

• 分离度（Rs）：Δ保留时间≥0.7 min，Rs≥1.5。

• 峰对称性：对称因子（As）0.9–1.1，避免拖尾影响定量。

3. 质谱（MS）参数设置

(1) 高分辨质谱（HRMS）

• 仪器：Orbitrap Exploris 480（分辨率120,000 @ m/z 200）或Q-TOF（分辨率40,000）。

• 电离模式：ESI负离子模式（[M-H]⁻）。

• 离子源参数：

• 喷雾电压：-2.8 kV

• 毛细管温度：320℃

• 鞘气流速：35 arb

• 辅助气流速：10 arb

(2) 数据采集模式

• 全扫描（Full Scan）：m/z 100–1500，分辨率≥70,000（Orbitrap）。

• 平行反应监测（PRM）：

• 选择母离子m/z 799.4834，采集所有子离子（分辨率≥35,000）。

• 碰撞能量（CE）：优化至25–40 eV（产生特征碎片）。

4. 串联质谱（MS/MS）解析

(1) 碎片离子差异分析

(2) 碎片路径验证

5. 数据解析与定量

(1) 提取离子色谱图（EIC）

• Rg1：提取m/z 799.4834±2 ppm，保留时间9.8 min。

• Rf：提取m/z 799.4834±2 ppm，保留时间10.5 min。

(2) 同位素分布验证

• 理论同位素分布（C₄₂H₇₂O₁₄⁻）：主峰m/z 799.4834，同位素峰m/z 800.4868（¹³C₁）。

• 匹配度：实测同位素丰度与理论值相似度≥90%（使用软件如Compound Discoverer™）。

(3) 定量方法（示例）

• 内标法：使用同位素内标Rg1-¹³C₆（[M-H]⁻ m/z 805.5035）。

• 标准曲线：0.1–100 ng/mL，R²≥0.995。

• LOQ：0.1 ng/mL（S/N≥10，质量误差<3 ppm）。

6. 挑战与解决方案

挑战1：同分异构体保留时间重叠

• 解决方案：

• 优化流动相梯度（如延长洗脱时间或调整乙腈比例）。

• 更换色谱柱（如使用苯基柱或氰基柱）。

挑战2：质谱碎片模式相似

• 解决方案：

• 采用多级碎裂（MS³）获取更精细的碎片信息。

• 结合同位素标记或衍生化反应引入质量标签。

挑战3：低丰度异构体检测

• 解决方案：

• 使用平行反应监测（PRM）或选择性离子监测（SIM）提高灵敏度。

• 富集样品（如固相萃取SPE）。

7. 总结

通过LC-MS联用技术分析同分异构体的核心步骤为：

1. 色谱分离：优化保留时间差异以实现基线分离。

2. 高分辨质谱：精确测定m/z，排除分子量相同的物质。

3. 串联质谱：解析基团丢失顺序与分子碎片，确定异构体结构。

4. 多维数据验证：结合保留时间、碎片离子及文献数据库交叉验证。